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Neubildung (Synthese) von Glucose aus Substratvorstufen des Citratzyklus wie Pyruvat, Oxalacetat und Dihydroxyacetonphosphat. Der tägliche Glucosebedarf eines erwachsenen Menschen beträgt ungefähr 160 g, wobei davon allein 120 g vom Gehirn genutzt werden. Die Menge an Glycogen, die im Körper gespeichert ist, beträgt etwa 400 bis 450 g (ca. 2000 kcal). Davon sind ca. zwei Drittel in der Muskulatur gespeichert und ca. ein Drittel in der Leber. Die verfügbare Menge an Glucose im Blut beträgt etwa 90 mg pro 100 ml Blut. Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) sind vollständig auf Glucose angewiesen, da sie die einzigen menschlichen Zellen ohne Mitochondrien (Krakftwerke der Zelle) sind. Daher müssen sie ihre gesamte Energie aus der Glykolyse beziehen.
Das Gehirn deckt seinen enormen Bedarf an schnell verfügbarer Energie hauptsächlich durch Glucose. Vor allem deshalb setzt bereits bei relativ kurzfristigen Hungerperioden die Synthese von Glucose ein, welche vor allem in der Leber und in der Nierenrinde und weniger im Gehirn, Skelett- und Herzmuskel stattfindet. Durch den Aufbau von Glucose in der Gluconeogenese sinkt der Glucosespiegel nie unter 60 mg/dl. Pro Tag können etwa 180 bis 200 g Glucose gebildet werden. Die Ausgangsstoffe der Gluconeogenese werden entweder in Form von Pyruvat oder Oxalacetat, als Produkte des Aminosäureabbaus (Eiweisabbau) und der Milchsäuregärung (aus Laktat), oder in einer Glycerinform aus dem Fettabbau, in den Stoffwechselweg eingeschleust.
